Denne side er et supplement til
BioNyt - Videnskabens Verden nr.158

Du kan tegne abonnement på BioNyt: Videnskabens verden her!

SPØRGSMÅL OG SVAR OM SPYT

Supplement til BioNyt Videnskabens Verden nr. 158

LÆS HELE ARTIKLEN OM SPYT I BioNyt Videnskabens verden, nr.158

Hvad er fordelene ved at brug spyt i stedet for blod som diagnosemiddel?

Spyttest i stedet for blodprøver? Jo, standardproceduren til at teste kroppens sundhedstilstand har længe været at bruge blodprøver, og det har i mange år været overset, at mundhulen og spyttet også afspejler kroppens sundhedstilstand, men de seneste 10 år er der kommet meget mere fokus på spyt(ref.10699)(ref.10700). Hvis man kunne undgå blodprøver og blot behøvede spyt til testning for sygdom og helbredstilstand ville man opnå en lang række fordele. Spyt er let at indsamle, lagre og transportere; mere sikkert for hospitalspersonale at håndtere end blod (ingen risiko for stik-skader, og der er mindre virus-koncentration i spyt end i blod); uden risiko for overførsel af infektion på grund af genbrug af usteriliserede nåle (et problem i u-lande); mindre problemer med bortskaffelse af affald (endnu et problem i u-lande uden autoklavering); kan indsamles af personen selv eller af utrænede personer (en økonomisk fordel); spytprøvetagning er stress-fri; spyt kan let indsamles i vanskelige situationer og fra børn, ældre, folk med nåleskræk, folk med sammenklappede vener, overvægtige personer og patienter, der af religiøse grunde ikke må give blod.

Spyttest ville kunne gentages igen og igen. Hele befolkningsgrupper ville kunne afgive spytprøver til test for en sygdoms samlede forekomst i befolkningen med henblik på større initiativer på sundhedsområdet (ref.10708).

Man ville nå flere mennesker, og sygdomme ville kunne opdages tidligere (jo tidligere en sygdom opdages, jo større er chancen for succesfuld behandling). Altså ville samfundet kunne spare penge til omfattende behandlinger, og patienter ville kunne undgå bivirkninger og senskader på grund af for sen diagnose. Tandlægen Skal tandlægerne inddrages i spytdiagnostik? Folk kommer hyppigere til tandlægen end til deres læge, og spyt ville kunne indsamles under et almindeligt tandeftersyn. Men der er ingen tradition for, at tandlægen direkte inddrages i screening for sygdomme.
Med spyttest vil man kunne nå flere mennesker, og opnå tidligere diagnose og derfor bedre udsigt til helbredelse og i tillæg opnå samfundsbesparelser.

I over 30 år har læger udnyttet test af spyt for forskellige sygdomme, men disse test var ikke særlig følsomme, og blev primært anvendt til at påvise steroidhormoner og antistoffer i spyttet. I fremtiden kan spyt derimod komme til at spille en helt ny, stor rolle. Spyt-diagnosticering vil i fremtiden kunne få stor betydning, fordi spyttest er nemme at tage, og fordi der er udviklet ultrafølsomme metoder, der ikke kræver specialuddannet personale eller avanceret temperaturstyring.

Kan tandlæger inddrages i diagnostik af kropssygdomme?

På Tandlægeforeningens årskursus i Bella Centeret 2013 blev det diskuteret, om tandlægerne skal inddrages i spytdiagnostik (ref.10700). Ikke overraskende var der nogen uenighed. Hvis debatten havde foregået blandt læger, ville der nok have været enighed om, at spytdiagnostik skal forbeholdes lægerne. Men inddragelse af tandlæger kan foregå på mange niveauer.

Det ville være nemt at inkludere udtagning af en spytprøve som en rutinesag ved kontrol af tænderne. Som det er nu, er det imidlertid op til patienterne selv at gå videre med tandlægens iagttagelser.

Der er nok ingen, der forestiller sig, at tandlægen skal stille en diagnose. En fremtidig model, hvor tandlægen videregiver sine observationer og eventuelle indledende målinger til patienten og patientens læge, er nok mere sandsynlig at få gennemført. En spytprøve fra munden kan tages med en vatpind, og vatpinden kan sendes til lægen. Viser prøven tegn på sygdom, kan lægen indkalde patienten til en mere detaljeret udredning.

Der foregår forskning om påvisning af sygdomme i spyt ved de odontologiske universitetsafdelinger Selv om der ikke er tradition for, at tandlægen stiller medicinske diagnoser, så forskes der ved nogle universiteters odontologiske afdelinger i spyttest til diagnoser.

Björn Klinge fra det odontologiske fakultet ved Malmö Högskola forsker i spyttest til sygdomme, der involverer inflammation (ref.10725). I et studie blev 500 personer i Skåne bedt om at udfylde et spørgeskema om sygdom og afgive en spytprøve. Dette studie viste, at man kunne påvise inflammationsfaktorer i patienter med diabetes, hjerte-kar-sygdomme og visse kræfttyper (ref.10706).

I Californien har UCLA School of Dentistry i Los Angeles fået 5 millioner dollar til at forske i sammenhænge mellem sygdomme og spyttets indhold af RNA uden for cellerne, (extracellulært RNA) (ref.10707).

RNA udskilles i mellemrummene mellem celler, hvorved det fungerer som et signal uden for spytkirtlerne (exokrint signal). Dette signalsystem findes i bl.a. maven og hjertet, men også i fingre og tæer samt altså i munden (ref.10707).

Den førende spyttest-forsker er David T. Wong. Han var den første, der (i 2004) påviste det extracellulære RNA i spyt (ref.10707). Han er redaktør på bogen Salivary Diagnostics, som blev udgivet i 2008 (ref.10724, bogen findes: UB2/KUB-NS-Nord).

Hvorfor sker udviklingen af spyttest til diagnosebrug så langsomt?

For at kunne bruge spyt til diagnose vil det være en fordel, at man kan besvare spørgsmål såsom: Hvad danner kirtelcellerne selv? Hvad kommer udefra? Hvordan transporteres stofferne over i spyttet? (Da forskellige stoffer ofte transporteres på forskellig måde, har transportmåden betydning for stoffernes koncentration i spyttet).

Spyttest vil utvivlsomt blive en helt ny industri, men udviklingen går langsomt, og en del af forklaringen på den langsomme udvikling af spytbaseret diagnosticering er, at der har manglet følsomme målemetoder. Men der har også manglet viden om spyttets biologi - bl.a. viden om transporten af biomolekyler fra blodet til spyttet (ref.10699).

Det er vanskeligt at finde pålidelige sammenhænge mellem biomolekylerne i blodet og i spyttet. Der er stor viden om sammenhængen mellem blodets indhold af biomolekyler og forskellige sygdomme, - men hvis man ikke kan relatere spyttets indhold af biomolekyler til et tilsvarende mønster i blodet, vil denne viden om sammenhængene mellem biomolekyler i blod og bestemte sygdomme ikke kunne udnyttes ved spyttest.

Hvad er forskellen på blod og spyt, når det gælder deres brug som diagnosemiddel?

Blodet har den diagnostiske fordel, at det gennemløber alle organer i kroppen. Blodet må derfor formodes at indeholde biomarkører fra alle organerne.

Spyttet afspejler i højere grad end blodet kroppens umiddelbare tilstand (men denne døgnvariation i spyttets biokemi er en svær ting at håndtere; og der er stor individuel variation og desuden varierer spytdannelsen med stimuleringen). Eftersom sammensætningen af biomolekyler i spyttet varierer i løbet af døgnet, er sammensætningen af biomolekyler i spyttet på et givent tidspunkt ikke en afspejling af den tilsvarende sammensætning i blodet, fordi der i blodet ikke er de samme døgnvariationer. Døgnvariationen i spyt kan derfor vanskeliggøre tolkningen af resultaterne. (Desuden mangler man undertiden forklaringer: Et studie har f.eks. kuriøst påvist, at amylase-dannelse i spytkirtlerne kan være en markør for søvnmangel (ref.10724s.98) ).

En anden ulempe ved spytdiagnoser er, at spyttets sammensætning kan være påvirket af måden, som spytprøven tages på. En stimulering af spytafgivelsen under prøvetagningen kan både være en fordel og en ulempe (ref.10699). Det forventes derfor, at det bliver nødvendigt at måle flere parametre i spyt for at kunne opnå en pålidelig diagnose, end det i dag kræves for blodanalyser (ref.10699).

Hvordan opsamles spyt til diagnoseformål?

For at kunne bruge spyt til diagnoseformål er det ofte nødvendigt at standardisere spyt-opsamling en, således at man kan finde sammenhænge mellem spyttets indhold af biomolekyler med det tilsvarende indhold af biomolekyler i blodet (ref.10699)(ref.10701). Det har ført til udvikling af kommercielle spytopsamlings-kit. De mest udbredte udstyr til spytopsamling er (ref.10699) (ref.10701):

OraSure www.orasure.com (hvor man med en nylonpind med specialbehandlet bomuldsvat på enden påviser spyttets eventuelle IgG-antistoffer mod HIV- og hepatitis-virus (smittepåvisning)).

Omni-SAL (hvor et stykke vat placeres under tungen til opsamling af IgG-antistof. Når en tilstrækkelig mængde spyt er absorberet i vattet skifter en indikator farve).

Salivette (hvor patienten skal tygge i et minut med en vatrulle af bomuld, placeret ved tandkødsranden) (ref.10734s.9).

Oracol (hvor en pind med et stykke absorberende skumstof på enden er beregnet til at kunne optage 1 ml væske, når der gnides 30 gange på hver af gummerne, som med en tandbørste, i 1 minut). Oracol anvendes i bl.a. England til påvisning af antistoffer mod mæslinger, HIV, hepatitis A og B, fåresyge og røde hunde (ref.10735s.8).

Både kortvarig spytopsamling på under 1 minut, og langvarig på over 15 minutter, giver upræcise tal for spytproduktion (ref.10724s.38). Interessant nok afgiver venstre øre-spytkirtel mere spyt end den højre. Dette udligner sig efter 10 min. (ref.10724s.38). Til brug for diagnose anbefales spytopsamling i 10 minutter(ref.10724s.38). (Ofte bruges dog 5 minutter til test for caries-risiko, men 15 minutter hvis man skal vurdere, hvor patientens manglende spytdannelse ligger i forhold til økonomisk tilskud til tandbehandlinger, fordi nedsat spytdannelse giver større risiko for tandsygdomme).

Personen bør ikke spise eller drikke i 1½ time før prøvetagningen. Patienten skal starte med at synke alt sit spyt, og må derefter ikke synke under spytopsamlingen, men savle ned i en kop, hvis vægt er kendt på forhånd. Personen skal under opsamlingen forholde sig så roligt som muligt og må ikke bevæge mund eller tunge (ved ustimuleret spytopsamling; samme procedure bruges ved stimuleret spytopsamling, men her tygger personen på f.eks. en smagløs paraffinklump).

Når tiden er gået, afsluttes der med, at patienten spytter i koppen. Den enkelte patient bør altid opsamle spyt på samme tidspunkt af døgnet, for at nedsætte virkningen af døgnvariation. Spytdannelsen er højere om vinteren end om sommeren, og spytdannelsen er nedsat ved højere omgivelsestemperatur (ref.10724s.38).

Under spytopsamling skal personen sidde komfortabelt, have åbne øjne, let fremoverbøjet hoved og have hvilet i 5 minutter (ref.10724s.39).

Opsamling i 10 min. bør give 3-7 ml spyt (ref.10751). Da bakterierne i spyttet hurtigt kan nedbryde eventuelle biomarkører, skal prøven straks nedkøles på is (evt. flydende nitrogen) for at nedsætte den enzymatiske aktivitet, og bakterierne i spyttet skal fjernes ved filtrering eller centrifugering (ref.10724s.71). Lagring bør ske ved under -20 grader Celsius (ref.10724s.73). Optøning bør ske hurtigt ved at komme prøven i varmt vand i kort tid, fordi langsom optøning ødelægger sårbare biomarkør-proteinmolekyler mere og medfører udfældning af mucinprotein-komplekser (ref.10724s.72).

Hvordan ændres spyttet når spytproduktionen øges?

Øget spytdannelse fortynder stofkoncentrationerne, men hæver også pH (så spyttet bliver mindre surt, hvorved nogle stoffer diffunderer tilbage over cellemembranerne og ud af spyttet). Ustimuleret spyt har et pH på ca. 6,8. Spyt fremkaldt ved stimulering har et let basisk pH-tal på ca. 7,4 (fordi bikarbonat-koncentrationen øges ved stimuleringen) (ref.10724s.32). Hvis spyttets pH f.eks. er 6,2 (surt) har personen risiko for at få huller i tænderne. I dette tilfælde vil tyggegummi være fordelagtigt, fordi spytstimuleringen altså øger pH-tallet.

Når et stof transporteres fra det forholdsvis pH-neutrale blod til det ofte mere sure spyt, vil der ske en ionisering af stoffet i spyttilstanden, og da disse ladede stoffer har sværere ved at transporteres over cellemembraner, kan de ikke komme tilbage igen. De ophobes derfor i spyttet. Ved øget sekretionshastighed får spyttet dog højere pH (dvs. det bliver mindre surt). Koncentrationen af stofferne bliver også mindre, når der er høj sekretionshastighed.

Hvor dannes spyt?

Man skelner mellem kirtelspecifikt spyt og fuldspyt (helspyt). Opsamling af kirtelspecifikt spyt - altså opsamling fra de enkelte kirtler - kan være vanskelig og anvendes mest til undersøgelse af kirtelspecifikke sygdomme. Oftest anvendes fuldspyt, der er en blanding af spyt fra hele mundhulen, og altså fra forskellige spytkirtler.

Biomolekylerne i spyttet er i høj grad dannet af spytkirtlerne selv. Men biomolekylerne kan også være kommet fra blodet(ref.10699).

Findes blodproteinerne også i spyttet?

Omkring 27% af proteinerne i blodet findes også i spyt (ref.10734s.10).

Afhængig af størrelsen og ladningen af biomolekylerne kan denne transport ske ved passiv diffusion (det gælder f.eks. for elektrisk-neutrale steroider), og ved såkaldt ultrafiltrering (ved indsivning via spalterne mellem cellerne) eller aktiv transport, f.eks. via receptor-binding, idet proteinerne fra blodet kan komme over i spyttet ved at være bundet til et receptor-protein (såkaldt ligand-binding). Bindingen medfører ændring af receptor-molekylets rumlige form, hvorved proteinet kan transporteres aktivt over membranen (ref.10699).

Ni grupper af proteiner udgør omkring 98% af proteinerne i spyttet. Resten (omkring 2%) består af over 1200 forskellige proteiner (ref.10699).

Hvor meget spyt producerer vi?

Spytproduktion og afsondring af spyt varierer fra individ til individ, men sunde, raske personer afgiver typisk fra 0,5 liter til 1,5 liter spyt pr. dag med en hastighed på 0,5 ml/min (ref.10699). Mængden af spyt afhænger af fysiologiske og patologiske tilstande samt af lugt- og smagsindtryk (ref.10699).

Hvad skyldes spytmangel?

Nedsat spytproduktion kan være tegn på sygdom. Sjögrens syndrom (autoimmun kirtelgigt) er ledsaget af nedsat spytproduktion. Også andre sygdomme er associeret med unormal spytfunktion: Bl.a. Prader-Willi syndrom (fejl på kromosom-15) samt stressrelaterede sygdomme (ref.10699).
Spytmangel Nogle mennesker føler, at de har mundtørhed, selv om deres spytdannelse er normal. Omvendt har nogle mennesker objektiv-målbart nedsat spytdannelse uden, at de oplever mundtørhed(ref.10724s.30). Spytmanglen kan dog medføre revner i tungen.

Spytmangel er oftest en bivirkning af medicin (beta-blokkere, beroligende midler og antipsykotisk medicin), som har den bivirkning, at de nedsætter nervesignalerne til spytkirtlerne (ref.10724s.30). Sjögrens syndrom En meget mindre gruppe patienter med spytmangel er mennesker med autoimmun reaktion mod spytkirtlerne. Det kaldes Sjögren's syndrom og findes hos 0,6% af befolkningen, og er 9 gange hyppigere hos kvinder end hos mænd. Det skønnes, at 2-4 millioner mennesker i USA har Sjögren's syndrom, der giver mundtørhed i en grad, så tør mad ikke kan spises og tale i længere tid bliver vanskelig (ref.10724s.189-197). Lindring kan opnås ved øget luftfugtighed under søvn, nedsat forbrug af alkohol, kaffe og krydderier, samt hyppig mundskylning.

Radioaktiv terapi mod hoved- og halsregionen (som behandling af kræftsygdom) kan medføre nedsat spytdannelse, i hvert fald ved de behandlingsprocedurer, der anvendtes tidligere.

Omkring 6-10% af en hel befolkning lider af mundtørhed, men for aldersgruppen over 50 år er andelen 25%, og for aldersgruppen over 80 år har 40% mundtørhed, men det skyldes bivirkninger af medicin (ref.10724s.31).

Årsagen er, at disse lægemidler ikke er helt specifikke, så midler mod f.eks. højt blodtryk vil bl.a. også virke på spytkirtlernes nervecelle-receptorer. Som tommelfingerregel gælder, at hvis der indtages mere end 4 lægemidler dagligt, vil mundtørhed være en sandsynlig bivirkning (ref.10724s.30). Over 1000 lægemidler har mundtørhed som en mulig bivirkning (ref.10724s.64). Det gælder f.eks. alle lægemidler, som binder acetylcholin.

Hvilke spytkirtler har vi?

Hos mennesket findes ca. 600 mindre spytkirtler, der er spredt rundt i munden under slimhinden, og tilsammen producerer ca. 10% af spyttet, samt tre par store spytkirtler, der producerer ca. 90% af spyttet:

Øre-spytkirtlen (glandula parotis (gl. parotidea) parotis-kirten, under huden over ramus mandibula).

Underkæbe-spytkirtlen (glandula submandibularis, den submandibulære, ved basis mandibula).

Undertunge-spytkirtlen (glandula sublingualis, den sublinguale kirtel, under tungen).

Hvad er spyt?

Spyt er et blandingsprodukt af forskellige stoffer. Fra spytkirtlerne udsondres en blanding af elektrolytter, proteiner, genetisk materiale, polysaccharider og mange andre molekyler. De fleste af disse stoffer kommer ind i spytkirtelsystemet fra de omgivende blodkar-kapillærer, men der dannes også stoffer i selve spytkirtlerne.

Det primære spyt dannes i de såkaldt sekretoriske endestykker, der består af acinære celler.

Spyt indeholder proteiner, som spytcellerne har dannet (bl.a. mucin, statherin og prolinrige proteiner).

(Dertil kommer små bidrag fra bl.a. tandkødet, madrester mellem tænderne, bakterier i eventuelle huller i tænderne, udsivende væske ved inflammation i tandkødet) (ref.10734s.4).

Indeholder spyttet antistoffer?

Spyt indeholder immunoglobulin-A (IgA), der dannes af immunceller. IgA er en dimer, altså bestående af to enheder, og disse holdes sammen som et dimerkompleks ved hjælp af et protein (kaldet J-kæden). Spytkirtelcellerne har receptorer, som binder dette IgA-kompleks, indtager det ved endocytose, og transporterer det tværs over cellen indpakket i en vesikel, og til sidst sendes dette immunoglobulin-A ud i spytkanalen (sammen med en del af receptoren, kaldet den sekretoriske komponent) (ref.10734s.6).

Ud over dette IgA er der i spyt også små mængder af antistoftyperne IgG og IgM.

87% af antistofferne i spyt er af typen IgA (ref.10734s.10). Niveauet af HIV-specifik IgA i spyt falder i takt med, at den smittede person udvikler symptomer, og IgA-tallet i spyt kan derfor bruges til at følge personens sygdom (ref.10734kilde 11). IgA fra spyt kan også påvise HIV-infektion i spædbørn (ref.10734s.11)

Hvilke metoder bruges til måling af stoffer i spyt?

Der er sket en kolossal udvikling i følsomme målemetoder, hvormed man faktisk nu kan måle helt ned til enkeltmolekyler. Ofte forekommer de interessante biologiske stoffer i meget små mængder i spyt, så interessen for at måle på spyt er først rigtig blevet stimuleret nu, hvor disse teknikker er opfundet.
Nye analysemetoder muliggør udbredelse af spytdiagnostik. Antallet af videnskabelige publikationer om afprøvning af forskellige metoder baseret på spytmålinger, er steget voldsomt (ref.10699) (ref.10700) (ref.10701). Følsomme analysemetoder er meget afgørende, fordi koncentrationen af de biomolekyler, man ønsker at måle i spyt, er 100 gange, ja endog undertiden 1000-3000 gange, lavere end koncentrationen af disse biomolekyler i blod (ref.10699).

Der sker i øjeblikket en rivende udvikling af spytdiagnosticering til brug i ulandene, dvs. med simple opsamlingsmetoder (ref.10705).

Hvor mange bakterier findes i munden?

Munden er fuld af bakterier, måske 500 forskellige arter, og spyt indeholder ca. 10 mill. bakterier pr. milliliter(ref.10724s.71).

Hvad er spyttets funktion?

Spyttet skal beskytte den øverste del af slimhinden i spiserøret, hvilket er vigtigt for, at maden lader sig synke, og for taleevnen (ref.10699).

En forudsætning for at kunne opretholde en god mundhygiejne er at have en tilstrækkelig spytproduktion, da spyttet indeholder mange beskyttende stoffer. Mundhulen oversvømmes hele tiden med spyt, som fjerner madrester og mikroorganismer, og spyt indeholder direkte bakterie-inaktiverende stoffer, bl.a. lysozym mod Gram-positive bakterier. Et andet spytprotein er histatin, som modvirker bakterierne ved at neutralisere giftige lipopolysaccharider, som Gram-negative bakterier har i deres cellemembran. Desuden hæmmer histatin bakterieenzymer, som skader tænderne (ref.10724s.160).

Lactoferrin er et jernbindende glycoprotein, som produceres af spytkirtlerne, og som hæmmer bakteriers vækst ved at gøre det sværere for bakterierne at få det jern, som de behøver til deres enzymer (ref.10724s.160).

Spytmangel medfører galopperende-hurtig karies (huller i tænderne). De såkaldte muciner i spyttet binder sig til bakterier og forhindrer, at bakterierne klæber til tand-emaljen. Spyt indeholder i øvrigt calcium og phosphat, som er hoved-byggesten for tandemaljens calcium-hydroxyapatit (ref.10724s.32). Hvis spyt kun var vand, ville vores tænder være opløst og væk i 20-årsalderen, har Frank Oppenheim fra Boston Universitets oral-biologiske afdeling sagt (ref.10724s.109).

Desuden indeholder spyt bikarbonat og andre ioner med buffer-evne, som neutraliserer syrer (bl.a. den mælkesyre, der dannes af mundbakterier), og spyt beskytter derved tand-emaljen mod demineralisering.

Ustimuleret spyt har et pH på ca. 6,8. Spyt fremkaldt ved stimulering har et let basisk pH-tal på ca. 7,4 (fordi bikarbonat-koncentrationen øges ved stimuleringen) (ref.10724s.32). Hvis spyttets pH f.eks. er 6,2 (surt) har personen risiko for at få huller i tænderne. I dette tilfælde vil tyggegummi være fordelagtigt, fordi spytstimuleringen altså øger pH-tallet.

Når et stof transporteres fra det forholdsvis pH-neutrale blod til det ofte mere sure spyt, vil der ske en ionisering af stoffet i spyttilstanden, og da disse ladede stoffer har sværere ved at transporteres over cellemembraner, kan de ikke komme tilbage igen. De ophobes derfor i spyttet. Ved øget sekretionshastighed får spyttet dog højere pH (dvs. det bliver mindre surt). Koncentrationen af stofferne bliver også mindre, når der er høj sekretionshastighed.

Indeholder spyt biomarkører for sygdomme?

Man har i spyt påvist biomarkører for bl.a. inflammationssygdom (C-reaktiv protein, CRP), hjerte-kar-sygdomme (hjerte-troponin), brystkræftmarkører (HER2-proteinet mv.), oral cancer (interleukiner, tumor-nekrose-faktor-alfa og andre immunproteiner) (ref.10701).

Kan man påvise HIV med en spytprøve?

Den amerikanske sundhedsstyrelse FDA har godkendt spyttest til påvisning af HIV. I en rapport fra EU omtales, at spyttest for HIV har høj sensitivitet (96,2% - 100% i forskellige studier) og endnu højere specificitet (99,6% - 100%) (ref.10735s.4).

I testen påvises HIV-specifikt IgG-antistof i spyttet.

Infektionen skyldes HIV-virus (human-immundefekt-virus), som angriber de såkaldte CD4-celler, som har en central rolle i immunforsvaret.

HIV-infektion vil uden behandling udvikle sig til AIDS (som kendetegnes ved en række følgesygdomme, som skyldes nedbrud af immunforsvaret).

I de første 3 måneder efter HIV-smitte er viruskoncentrationen i kroppen (og dermed smittefaren) størst. I de første 1-4 uger kan HIV-antistof ikke måles i blodet, men det vil være muligt at måle HIV-antigen (dvs. HIV-virusprotein) i en blodprøve. Ved hjælp af en PCR-test kan man også påvise RNA (og kopi-DNA) fra HIV. Derfor kan man nu teste personer, når de henvender sig, og de skal ikke mere vente i f.eks. 3 måneder. Et sikkert negativt svar kan gives efter 4 uger (ref.10734s.10).

Det er lettere at få folk til at acceptere en spyttest for HIV end en blodtest. Brugen af spyttest for HIV muliggør hjemmetest (hvilket dog kan være etisk problematisk).

87% af antistofferne i spyt er af typen IgA (ref.10734s.10). Niveauet af HIV-specifik IgA i spyt falder i takt med, at den smittede person udvikler symptomer, og IgA-tallet i spyt kan derfor bruges til at følge personens sygdom (ref.10734kilde 11). IgA fra spyt kan også påvise HIV-infektion i spædbørn (ref.10734s.11).

Desuden kan HIV-test fra helspyt bruges til at overvåge antistof-responset hos HIV-smittede personer ved at måle på tilstedeværelse af IgG-antistof, der er HIV-specifikt (påvist med ELISA-test og efterfølgende bekræftet med Western-blot test). Kræft-påvisning i spyt Kræft skal helst påvises tidligt. Man vil typisk påvise kræft ved en biopsi (udtagning af en vævsprøve), men denne metode kan ikke bruges til screening af en befolkning. En spyttest ville derimod være velegnet.

Kan en spytprøve påvise bugspytkirtel-kræft, pankreas-kræft?

Bugspytkirtel-kræft også kaldet pankreas-kræft blev i 2010 påvist med 90% (høj) følsomhed og 95% (høj) specificitet ved at screene spyt for fire mRNA-biomarkører, der er specifikke for denne kræftform (ref.10701).

Kan en spytprøve påvise brystkræft?

Kvinder med brystkræft har forhøjet niveau af en brystkræft-markør HER2/neu i både spyt og blod (ref.10701). Desuden er brystkræft-markøren CA15-3 forøget, og tumor-repressor-protein-p53 er nedsat i spyt hos kvinder med brystkræft (ref.10701).

Studier tyder på, at brystkræft hos kvinder kan findes ved at påvise et højt niveau af to kræft-biomarkører (dels den omtalte CA15-3 og dels "erb"), men specificiteten kan være så lav som 70%(ref.10734kilde 12). Dog kan spyttest for tumor-markører være med i en pulje af test, som tilsammen kan udgøre en diagnostisk test, og evt. skal man lade et computerprogram om at give diagnosen ud fra delresultaterne. Oral cancer Kræft i mundhulen ledsages af ændringer i biomarkører i spyt (øget transferrin, øget cyclin-D1, nedsat mængde maspin) foruden af specifikke mRNA’er (hvor spyt-måling faktisk er bedre end blod-måling)(ref.10701).

Kan en spytprøve påvise oral cancer, kræft i mundhulen?

Oral cancer har en dårlig prognose, idet 50-60% dør inden 5 år. p53-påvisning i spyt kan f.eks. bruges til diagnose af oral kræft (ref.10734kilde 11).

Hvis spyt indeholder meget af det forsvarspeptid, der kaldes defensin-1, er dette også en indikator for oral cancer (ref.10734kilde 11).

Kan en spytprøve påvise kræft?

Ved cancer er dannelsen af proteinet p53 ofte nedsat. p53 er et tumor-hæmmende protein, som syntetiseres af celler, der udsættes for DNA-skadelig stress (f.eks. stress på grund af solpåvirkning). Hvis mutationerne inaktiverer p53-produktionen, øges risikoen for kræft. Dannelse af det inaktive p53-protein kan medføre, at kroppen laver antistoffer mod dette protein.

Sådanne p53-antistoffer findes i blodet hos patienter med forskellige kræftformer. p53-påvisning i spyt kan f.eks. bruges til diagnose af oral kræft (ref.10734kilde 11).

Hvad er p53?

p53 er et tumor-hæmmende protein, som syntetiseres af celler, der udsættes for DNA-skadelig stress (f.eks. stress på grund af solpåvirkning). Ved cancer er dannelsen af proteinet p53 ofte nedsat. Hvis mutationerne inaktiverer p53-produktionen, øges risikoen for kræft. Dannelse af det inaktive p53-protein kan medføre, at kroppen laver antistoffer mod dette protein.

Sådanne p53-antistoffer findes i blodet hos patienter med forskellige kræftformer. p53-påvisning i spyt kan f.eks. bruges til diagnose af oral kræft (ref.10734kilde 11).

Hvis spyt indeholder meget af det forsvarspeptid, der kaldes defensin-1, er dette en indikator for oral cancer (ref.10734kilde 11).

Hvad er defensiner?

Hvis spyt indeholder meget af det forsvarspeptid, der kaldes defensin-1, er dette en indikator for oral cancer (ref.10734kilde 11).

Kan spyttest måle hormoner?

Påvisning af hormoner i spyt kan bruges til diagnoser for kirtelsygdomme, psykologiske diagnoser, fertilitets-undersøgelser, doping/sportsmedicin og adfærdsstudier. Man kan i spyt måle testosteron, progesteron og estriol - samt cortisol, der dog diffunderer langsomt over cellemembranerne; cortisol-hormonet øger dannelsen af glucose under stress, men udviser stor døgnvariation. En bedre måling af stress opnås ved spyt-måling af hormonet chromogranin-A, som er et peptid, der udskilles samtidig med katekolaminer, som er akutte stress-parametre(ref.10734s.15).

En sygdom, der medfører overproduktion af cortisol (Cushing syndrom), kan påvises med spyttest, der dog skal bekræftes ved en urintest(ref.10734s.15). Tilstanden kan bl.a. skyldes hypothalamus-tumor, der medfører overproduktion af CRH (corticotropin), der på sin side fører til øget udskillelse af ACTH (adrenocorticotropisk hormon), som i sidste ende fører til øget udskillelse af cortisol fra binyrebarken.

Ved medfødt mangel på cortisol (adrenal hyperplasi) mangler et enzym til at omdanne steroidhormonet 17alfa-hydroxyprogesteron til cortisol. Diagnosen kan stilles ved en spyttest, der påviser ophobning af 17alfa-hydroxyprogesteron (ref.10734s.15).

Diagnose af fertilitetsproblemer kan tænkes at være mulig ved spyttest for kønshormoner. Hormonerne for den kvindelige cyklus kan nemlig måles i spyt (progesteron og estradiol). Ligeledes kan testosteron måles i spyt hos mænd. Hvis der måles under 0,2 nanomol testosteron pr. liter i spyt er det tegn på hypogonadisme (ref.10734s.15). Spyttest kan i øvrigt dokumentere doping med testosteron (nemlig påvisning af unormalt højt testosteron-tal i forhold til kroppens epitestosteron) (ref.10734s.15).

Det er vanskeligt at lave spytmåling for kortison, hypofyse-hormoner, proteinhormoner og DHEA (dehydroepiandrosteron). Det skyldes, at medens de ovenfor-nævnte hormoner er fedtopløselige og nemme at transportere over spytkirtelcellerne, fordi de er ukonjugerede stoffer, er de sidstnævnte (kortison, hypofyse-hormoner, proteinhormoner og DHEA) konjugerede stoffer, dvs. bundet covalent til et højpolært molekyle, og derfor vandopløselige, dvs. mindre fedtopløselige.

Insulin kan (modsat andre hormoner) transporteres aktivt over spytkirtel-cellemembranerne (ref.10734 s.13, kilde12). Tobak og narkotika Når man indtager medicin eller ryger en cigaret vil dette efter ganske kort tid kunne spores i spyttet. Udsættelse for passiv rygning, samt brug og misbrug, kan altså derved afsløres. De fleste medikamenter er enten svagt basiske eller svagt sure. De basiske stoffer har tendens til at ophobes i spyttet, fordi de ioniseres i det lidt sure spyt, og derfor ikke kan diffundere tilbage i cellerne igen.

Kan spyttest påvise narkotika?

Kokain på fri base-form kan påvises i spyt, og ved også at måle nedbrydningsproduktet BZE kan tidspunktet for kokain-indtagelsen afsløres. Nedbrydningsproduktet BZE kan påvises i op til 10 dage med en grænseværdi på 1 ng/ml (ref.10734s.17).

Kan spyttest påvise rygning?

Nikotin er et basisk alkaloid, som findes i spyttet allerede 2-5 minutter efter, at man har været udsat for passiv rygning. Man måler dog på nedbrydningsproduktet cotinin, fordi det har en halveringstid på 20 timer (hvorimod nikotin-koncentrationen halveres på 3-6 timer). Hvis det er tandlægens opgave at få folk til at stoppe med at ryge kan en spyttest altså afsløre, om de rent faktisk er stoppet. Desuden kan testen påvise passiv rygning. (Passiv rygning i hjemmet har størst skadelig virkning (ref.10734s.19)).

Hvordan opfattes spyt i forskellige kulturer?

Den russiske forsker Ivan Pavlov blev kendt for et forsøg, hvor hunde begyndte at savle, når de hørte en klokke, som angav, at de snart ville få mad. Spytproduktion er tæt forbundet med tanken om mad. Ikke desto mindre har forskellige folkeslag yderst forskellig holdning til spyt, fra meget negativ til meget positiv.

Opdagelsen af, at spyt og nys kan bære smitte var med til at give spyt negative associationer. Midt i 1800-tallet, før disse opdagelser, var spytning almindelig, f.eks. hos folk, der tyggede skråtobak. Da den tyske læge Robert Koch opdagede, at spyt kunne indeholde tuberkulosebakterier, fik spyt en negativ klang.

Selv om vi danner ca. 1½ liter spyt om dagen, er spytning kun socialt tilladt for sportsstjerner inden for f.eks. baseball, for at signalere maskulinitet, og i andre sportsgrene spyttes for at bede om held (spytte i hænderne, f.eks.). At spytte på nogen er en yderst hånlig handling.

I Peru, Bolivia, Venezuela og lande langs Andes-bjergkæden fremstilles stadig alkoholiske "chicha"-drikke af maniok-rod, majs og frugter ved at bruge spyt som den fordøjende og fermenterende kilde. (Ordet stammer fra spansk - for spyt eller at spytte).

Grækerne spytter for at forhindre ulykker, selv under ceremonier i den græsk-katolske kirke. Når præsten døber et barn spytter han tre gange på jorden for at repræsentere den hellige treenighed og afvise djævelen. Under græske bryllupper spytter gæsterne på bruden for at ønske held og lykke. Det er også almindeligt, at grækere spytter på tøj og hinanden under hilsen for at undgå det onde øje.

I Somali anvendes spyt som et primitivt helsemiddel mod åbne bylder. Mod smertefulde slangebid bruger somalierne i Afrika en blanding af smør og spyt. Hos Azande-folket i Sudan og Masai-folket i Østafrika bruges spyt som førstehjælp mod mindre sår, evt. blandet med urter. Hos Bena-folket i Tanzania bruges spyt til at behandle forbrændinger og Masia-stammen bruger spyt mod insektbid og opsvulmning.

Wolof-stammen i Afrika tror spyt medbringer en spirituel velsignelse fra spyttets ophavsmand, og en nyfødt smøres ind i spyt fra de, der vil barnet det godt. Hos Ashanti-folket i Ghana skal bedstefaderen direkte spytte ind i den nyfødtes mund for at barnet kan blive spirituelt oplyst.

Siden for 4000 år siden er "betelnød" (en blanding af areca-nød, betel-blade og lime) blevet tygget i Thailand, Indien, Phillipinerne, Taiwan og Indonesien. Planten frigiver alkaloider, som let absorberes igennem mundslimhinden og medfører ekstrem stor produktion af rødbrunt spyt. Den medfølgende spytten opfattes som en del af det at have en god personlig hygiejne. Efter udbruddet af SARS-epidemien i 2003 i Kina, Hong Kong og Taiwan er der blevet indført bøder for at forhindre offentlig spytten. I Singapore kan bøden være op til 25.000 kr.

Spyt indgår naturligt i et kys mellem kærester, hvorimod folk er ret så tilbageholdende med at udveksle spyt med fremmede. Nogle hundeejere er villige til at acceptere et slik fra deres hund, men ofte ikke fra en hund, der ikke er deres egen.

Det er ofte tabu at dele en ske, tandbørste eller sugerør, fordi det har rørt ved den anden persons spyt.

Der kan være psykologiske faktorer som gør, at folk har svært ved at acceptere, at spyt indeholder diagnostisk information om den persons krop, som spyttet kom fra. Der synes således at være en psykologisk skelnen mellem spyt, der stadig er i en persons mund, og spyt, som ikke mere er i personen - som om spyttet dermed er blevet fremmed og ikke-selv(ref.10724 s.104-109)).

Hvordan styres spytdannelsen?

Spytdannelsen stimuleres både af det sympatiske nervesignalsystem [transmitter-stof: noradrenalin] og af det parasympatiske nervesignalsystem [transmitter-stof: acetylcholin].

En stimulus fører til, at cellens endoplasmatiske reticulum frigiver frit Ca++. Den pludselige frigivelse af calcium medfører, at porte for kalium-ioner (K+) åbnes, så kalium-ionerne farer ud af cellen (cellen har indre overskud af K+ på grund af natrium/kalium-pumpens ATP-energikrævende pumpeaktivitet).

Cellens tab af de positive kalium-ioner (K+) ud af cellens "bagdør" medfører et tilsvarende tab af de negative chlor-ioner (Cl-) ind til spytkanalen (lumen). Derved opstår en elektrisk-negativ ubalance i spytkanalen, som medfører, at (de positive) natrium-ioner (Na+) siver ud i spytkanal-lumen - via mellemrummene mellem cellerne [paracellulært]). Da der nu er mange natrium-ioner og chlor-ioner i spytkanalen er der dermed blevet skabt et osmotisk overtryk her, som får vand (H2O) til at diffundere ud i spytkanalen - dels ud af cellerne[transcellulært] og dels via mellemrum mellem cellerne. Derved er der dannet primær spyt (med visse ligheder til blodvæske). [Senere i spytkanalens forgrenede gange reabsorberes 98% af natrium-ionerne og 76% af chlor-ionerne, dog kun henholdsvis ca. 69% og 60% under tygge-stimulering)]. Den sekretoriske spytkirtel-endecelle vender i øvrigt tilbage til udgangspunktet ved at igangsætte transportsystemer, som reetablerer de oprindelige ion-gradienter fra før cellen blev stimuleret til at lave spyt. De reetablerende transportsystemer er: Den ATP-krævende pumpe: 1: Den energikrævende, ATP-drevne 3Na+/2K+-pumpe. De ikke-ATP-krævende svingdørs-transportsystemer: 2: Co-transporteren Na+/K+/2Cl- . 3: (Na+)ind i cellen/(H+)ud i spytkanal-lumen. 4: (Cl-)ind i cellen/(HCO3-)ud i lumen (dette Cl-/HCO3- system kræver carbon-anhydrase-enzymets omdannelse af CO2 og H2O til HCO3- og H+).

Kan syfilis påvises med en spyttest?

Med en spyttest kan påvises antistoffer mod syfilis-bakterien (TRFIA-test = Time Resolved Fluorescence Immuno Assay for IgG-antistoffer mod Treponema).Det kan i nogle lande være vanskeligt at få kontakt til befolkningsgrupper, der har risiko for at blive smittet med syfilis. Her kan spyttest være praktisk. Den spyttest for syfilis, som man har til rådighed, kan bruges til epidemiologiske studier, men har ikke følsomhed nok til at være brugbar til diagnose eller screening, og kan ikke skelne mellem aktiv infektion og tidligere/behandlet infektion (ref.10735s.7)

Hvad er en ELISA-test?

Test af spyt har traditionelt været udført med ELISA-metoden (enzymkoblet immuno-sorbent-analyse). ELISA-teknik bruges ved mange diagnostiske tests, bl.a. graviditets-test.

En ELISA-test bygger på reaktionen mellem et relevant målprotein og et specifikt antistof, der er mærket på en sådan måde, at målprotein/antistof-komplekset kan påvises.

Dette dannede målprotein/antistof-kompleks indfanges af et andet specifikt antistof, som er fasthæftet til et bæremateriale (immobiliseret til en plastoverflade eller til magnetiske kugler), hvorved det bliver lettere at bortvaske de ikke-bundne stoffer.

Antistoffet kan være mærket med et enzym (f.eks. peroxidase). Mængden af enzymaktivitet (f.eks. altså peroxidase-aktiviteten) vil så svare til mængden af mål-proteinmolekyler.

Derefter tilsættes en væske, der skifter farve eller bliver fluorescerende, hvis det aktive enzym er til stede.

Farvereaktionen kan ske ved, at enzymet omdanner det ikke-farvede eller ikke-fluorescerende substrat til et farvet eller fluorescerende produkt, som kan måles.

Jo mere farve, der dannes, jo mere er der af det pågældende målprotein i prøven.

Farveintensiteten måles i et fotometer.

ELISA-testen udføres på små plastikplader med 96 “brønde” (små fordybninger i pladen) til de enkelte prøver. En sådan analyseplade muliggør automatisering af analysen.

ELISA-testene har givet en sensitivitet på 96% [det vil sige at 96% af de-rent-faktisk-positive som forventet var positive i testen] og en specificitet på 99,9% [dvs. at 99,9% af de-rent-faktisk-negative som forventet var negative ifølge testen] (ref.10734s.8).

Man har videreudviklet en ELISA-test til spyt. Den kaldes GAC-ELISA (IgG-antibody-capture-ELISA). I visse studier er opnået sensitiviteter på 98-100% og specificiteter på 97,7-100% (ref.10734s.9).

Trin 1: Antistof bundet til en plade. Trin 2: Prøve (med målstof) tilsættes, og fanges af antistof på pladen. Trin 3: Antistof (kemisk bundet til enzym) tilsættes. Bindes via antistof-delen til målstoffet. Trin 4: Substrat tilsættes og giver signal via enzym.

Sandwich-princippet i ELISA-testen (Bemærk at figuren skal læses nedefra; fra trin 1 til trin 4). Antistoffer binder målstoffet (trin 1-2). Et enzym fremkalder et signal, som registreres (trin 3-4). I denne version af en ELISA-test er et antistof bundet til en testbrønd-væg. (Vist nederst på tegningen). En prøve tilsættes, og hvis målstoffet findes i prøven, bindes målstoffet til antistoffet (alt andet vaskes væk). Målstoffet bindes derefter til et antistof/enzym-kompleks, som ved substrat-tilsætning fremkalder et fluorescens-signal).

Hvad er en PCR-test?

I 1980’erne blev der opfundet en PCR-teknologi (polymerase chain reaction), som var meget mere følsom end ELISA-testen. Det grundlæggende princip ved PCR er beskrevet udførligt i BioNyt nr. 72(ref.10702).

PCR-teknikken bygger på opformering af det bestemte område af det genetiske materiale, DNA, som man ønsker at påvise i en biologisk prøve. (DNA-området kan f.eks. indeholde en basesekvens, der kendetegner en genetisk sygdom, eller som stammer fra et virus eller en parasit). Kopieringen af dette DNA går lynhurtigt ved hjælp af PCR-metoden: På få timer kan man få rigeligt med DNA til nærmere undersøgelser.

Ved PCR-metoden kræves meget lidt DNA som udgangspunkt, fordi opformeringen af det valgte DNA-stykke er så præcis. Dette er basis for metodens anvendelighed. For at undgå forurening med andre DNA-sekvenser, er det imidlertid nødvendigt, at processen forløber afskærmet fra omgivende forureningskilder. PCR i korte træk: Trin 1: Kraftig opvarmning til ca. 95°C i 1-2 minutter. (Det dobbeltstrengede DNA adskilles derved). Trin 2: Temperaturen sænkes langsomt til 55°C i 2 minutter. (Der tilføres to PCR-primere, som er fremstillet til specifikt at binde til det stykke DNA, der skal kopieres, ”målsekvensen”). Der er to primere, fordi de bindes til hver af de to strenge i DNA, se figuren overfor. Trin 3: Temperaturen hæves til 72°C. (DNA-syntesen sættes i gang med enzymet DNA-polymerase, der kan tåle denne høje temperatur. DNA-polymerase-enzymet kan kun påsætte deoxyribonukleotider på enden af PCR-primeren. Derfor starter kopieringen kun ved målsekvensen).

Ved at gentage processen 20-40 gange, dannes flere og flere målsekvenser, som efterfølgende kan bestemmes.

DNA-polymeraseenzymet, der bruges ved PCR-metoden, har to vigtige begrænsninger: Enzymet kan ikke selv starte DNA-syntesen (men skal have en primer-ende; 3’OH), og enzymet kræver en skabelon i form af den anden DNA-streng. Disse to krav sikrer, at man kan opformere målsekvensen på en specifik måde (ref.10702).

PCR-metoden stiller særlige krav til analyseudstyr og uddannelse af personalet. Metoden er omstændelig at udføre på grund af de gentagne temperaturskift, og der er risiko for opformering af ikke-relevant nukleinsyre. PCR-metoden er af disse grunde ikke blevet udbredt uden for specialiserede laboratorier.

Billig PCR-maskine: Billige apparater kan godt være avancerede. Hollandske "biohackers" har udviklet en qPCR-maskine i skotøjsæske-størrelse til ca. 1500 kr. Apparatet hedder Amplino. Den kan ud fra en blodprøve påvise malaria, endog parasit-stammen. Hver prøve koster 5-6 kr. Apparatet skal afprøves i Zambia. For brugeren er testen simpel: Et prik i fingeren, bloddråben opsuges med en strimmel, som indsættes i apparatet og 20 minutter efter aflæses resultatet.

Apparatet har brug for enzymer, DNA-byggesten og korte DNA-stykker, som parres med malaria-DNA'et. DNA-proberne afgiver et fluorescerende signal, når de finder malaria-DNA. Der kan anvendes forskellige DNA-prober for hver malaria-stamme, og farvesignalet kan være forskelligt, så malaria-stammen også kan aflæses. Opkobling til Internettet muliggør cloud-dataindsamling og GPS-lokalisering, som viser smitteforekomsten i landet.

Ved de nuværende metoder til påvisning af malaria (mikroskopi eller hurtigtest-kit) bliver nogle smittede ikke diagnosticeret og malaria-stammen bliver ikke bestemt.

En malaria-infektion er særlig farlig for en gravid, som samtidig er smittet med HIV. HIV-virussets ødelæggelse af immunforsvaret medfører, at malariasygdommen bliver voldsom, og samtidig bliver der dannet flere HIV-virus i kroppen. I forvejen er gravide særlig udsatte for malaria, fordi immunsystemet er hæmmet på grund af graviditeten, og fordi malaria-parasitten kan gemme sig i moderkagen, så den er langt vanskeligere at påvise.

De fleste dødsfald på grund af malaria er hos børn under 5 år, fordi deres immunsystem endnu er svagt udviklet. Årligt dør omkring 655.000 mennesker, især børn, af malaria. 90% af disse dødsfald er i landene syd for Sahara. Der foretages årligt ca. 16 millioner diagnoser for malaria, men behovet er ca. 1500 millioner. Ukorrekt diagnose kan medføre dårlig udnyttelse af midlerne mod malaria og udvikling af resistens hos parasitten.

Det billige PCR-apparat vil også kunne udvikles til påvisning af bakterier og virus, bl.a. HIV.

Hvad er RCA-teknologi?

RCA-teknologien er en afløser for PCR-metoden, især fordi PCR-metoden kræver, at temperaturen styres, og hele tiden veksler mellem 95°C / 55°C / 72°C. Det kan ganske vist automatiseres, men kræver laboratorieudstyr. RCA-metoden kræver ingen temperaturstyring.

RCA-metoden blev opfundet i begyndelsen af 1990’erne. I første omgang var det en ny metode til opformering af DNA og forstærkning af signalet til bl.a. diagnoser (ref.10703). Metoden opformerer DNA'et ved at lade et DNA-polymerase-enzym aflæse cirkulært DNA igen og igen under nydannelse af DNA undervejs. Fordele ved RCA-metoden RCA-metoden har et helt afgørende træk: Den kan foregå ved omgivelsestemperatur (isotermisk). Dette muliggør analyse uden opvarmning - og kan dermed udføres uden elektricitet(ref.10703). Det giver RCA-metoden et stort potentiale på steder i verden uden elektricitet (ref.10705).

RCA-metoden er (sammenlignet med PCR) desuden mere enkel at udføre, meget følsom og specifik og kan påvise ikke blot DNA og RNA (som PCR-metoden er begrænset til), men kan også påvise proteiner og andre biomarkører (ref.10708). I princippet kan der ved hjælp af RCA-metoden hurtigt og simpelt stilles en diagnose på mange livstruende sygdomme - blot med en lille blodprøve eller en lille spytprøve.

Mål-DNA: RCA-metoden til opformering af DNA bygger altså på, at man på forhånd kender basesekvensen for det stykke DNA ("mål-DNA'et", target-DNA), som man vil påvise og opformere til et signal-niveau, hvis det eventuelt findes i prøven.

En ringformet hjælpeprobe er ofte nødvendig i RCA-metoden: Der anvendes typisk en hjælpeprobe, der kan danne en DNA-ring. Hjælpeproben har i enderne DNA-områder, som er komplementære med mål-DNA'et.

Hybridisering mellem den ringformede hjælpeprobe og mål-DNA'et (target-DNA): Da hjælpeprobens ender er komplementære med mål-DNA'et, hybridiserer de til mål-DNA'et. Det sker, når hjælpeproben opdager mål-DNA'et. Derefter er det opgaven at gøre dette til et synligt signal.

DNA-polymerasen: RCA-metoden medfører nydannelse af DNA, som er en kopi af mål-DNA'et. Til nydannelse af DNA kræves et DNA-polymerase-enzym (som navnet siger laver enzymet en polymer af DNA-molekyleenheder).

RCA-primeren DNA-polymeraseenzymet kræver en RCA-primer (et oligonukleotid af deoxyribonukleotider), som enzymet kan starte på. Polymeraseenzymet kan nemlig ikke starte sin DNA-syntese på enkeltstrenget DNA.

Enzymets funktion i RCA DNA-polymerase-enzymet starter i enden på primeren, og nydanner derefter DNA, som er komplementært med den ringformede DNA-streng. DNA-polymerase-enzymet aflæser altså det ringformede DNA i omgang efter omgang, cirkel efter cirkel, rundt og rundt.

Hvis der kun er én type primer tilstede danner enzymet en lang tandem af forbundne kopier af det cirkulære DNA. Dvs. gentagne DNA-sekvensstykker, som perler på en snor. Aflæsningen af DNA-cirklen kommer til at ligne situationen, hvor man ruller en ledning af en tromle - blot med den forskel, at ”ledningen” dannes undervejs.

Dannelsen af RCA-produktet
Under tilstedeværelse af de 4 deoxyribonukleotider, som er byggesten for DNA, ruller den ene kopi efter den anden af det cirkulære DNA, medens det allerede dannede DNA undervejs løsnes fra dobbelt-DNA-strengen. Produktet ruller af det cirkulære DNA, deraf navnet RCA, ”rolling circle amplification”, eller i korthed RCA-metoden.

Amplifikation betyder (signal)forstærkning. Signalet forstærkes, fordi der sker en opformering af DNA'et. En dansk oversættelse kunne være ”rullecirkel-forstærkning”, ”rullecirkel-opformering”, ”rullecirkel-amplifikation”, ”rotationscirkel-amplifikation” eller lignende).

Opformering af DNA: Hvis DNA-polymerasen katalyserer syntese af det cirkelformede DNA f.eks. 1000 omgange, bliver der dannet 1000 delprodukter. Disse delprodukter har alle information om mål-DNA-sekvensen og signalsekvensen.

Kobling til en fast overflade: Man lader ofte RCA-primeren være koblet til en fast overflade. Derved hænger hele tandem-sekvensen fast til denne overflade (immobilisering). På denne måde kan man synliggøre et enkelt mål-DNA i en vævsprøve, fordi det lange stykke af nydannet DNA hænger fast på den faste overflade, og her afgiver et signal.

Signalet: Hjælpeproben kan indeholde en signalsekvens, der senere kan bruges til at synliggøre slutproduktet. På DNA-polymerasens vej bliver denne hjælpeprobes signalsekvens aflæst.

Hver runde giver et delprodukt, som dels indeholder information om mål-DNA-sekvensen, dels signal-sekvensen.

Synliggørelse af den afrullede streng af kopi-DNA kan ske ved, at en af de fire deoxyribonukleotider var mærket med et fluorescerende molekyle.

Synliggørelsen kan også ske efter at overskydende reagens er vasket væk - nemlig ved at tilsætte fluorescensmærkede oligonukleotider, som hybridiserer med det nye DNA (dvs. binder sig specifikt hertil) (ref.10713).

Fremgang for RCA-analysen Vadim V. Demidov opsummerede i 2005, hvordan ti-året 1995-2005 var gået med hensyn til analyser inden for DNA-diagnostik (ref.10708). I 2005 var PCR stadig den dominerende analysemetode ved DNA-diagnostik. Men PCR var ved at blive indhentet af de metoder, som ikke kræver opvarmning i løbet af analyseprocessen - og især RCA-metoden var blevet mere og mere populær. I 2005 arbejdede flere biotek-firmaer på at udvikle en kommerciel diagnoseanalyse baseret på RCA-princippet (ref.10708) (bl.a. Quiagen og Hamilton Thorne Biosciences fra USA, Amersham Biosciences fra UK, Olink Bioscience fra Sverige og Biokit fra Spanien). RCA-metoden er senere blevet modificeret på utallige måder (ref.10703). (ref.10705). RCA-patenter Udviklingen af RCA blev hæmmet af patentsituationen (ref.10708). Patenter kan både fremme og hæmme udviklingen. Det første patent inden for et nyt felt er ofte formuleret meget bredt for at sætte sig på hele feltet. Al efterfølgende udvikling kommer i voldsom afhængighed af det første patent, og der betales licenser for kommerciel udnyttelse.

Dette skete med RCA-metoden. Den første patentansøgning havde J. I. Auerbach som opfinder og titlen ”Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules”. Den blev i 1994 til US-patent nr. 5.354.668 (ref.10708). I 1990’erne kom mange andre patentansøgninger. Situationen blev kompleks med gensidig afhængighed mellem de forskellige patenter (ref.10708). En sådan situation kan føre til store stridigheder om rettighederne.

Et patent giver kun en geografisk afgrænset ret. Et US-patent gælder således kun i USA. (Danmark kan være dækket af et nationalt patent eller af et europæisk "EP-patent").

Det kræver et stort arbejde at afklare, i hvilke lande der findes et gyldigt patent på en teknologi. Videreudvikling af RCA-test: RCA-teknologien kan bruges sammen med mange forskellige målemetoder. Den omfattende udvikling af RCA-teknologien siden starten i 1990’erne opsummeres af danske forskere i en artikel med ikke mindre end 206 referencer (ref.10718).

RCA-metoden er blevet kombineret med meget avancerede målemetoder, men det mest spændende er nok, at RCA kan tilpasses til brug under meget lav-teknologiske forhold, og derfor kan finde anvendelse uden for de specialiserede laboratorier, - altså f.eks. hos den praktiserende læge eller endog af den enkelte patient (ref.10718).

Når man kan måle markører på en enkelt celle, bliver det muligt at måle på materiale, hvor ikke alle celler er ens. Dette er tilfældet ved kræft, hvor der på samme tid findes mange forskellige celletyper, nemlig dels de såkaldte kræft-stamceller og dels de mere eller mindre differentierede kræftceller. Det vides ikke, hvordan disse forskellige celler påvirker udviklingen af kræft og behandlingen af kræft.

Med de nye teknikker til påvisning af enkelt-molekyler i enkeltceller åbnes der altså op for nye forskningsområder (ref.10718).

Minidråbe:RCA kombineret med en teknologi kaldet microfluidic nano-liter platform åbner en helt ny verden Ved mange af de tidligere anvendelser af RCA-teknologien foregik reaktionen på en fast overflade, hvor produktet fra RCA forblev bundet til den faste fase og altså blev påvist her.

Denne opsætning med en fast overflade er imidlertid ikke anvendelig i alle tilfælde, så forskere er gået på jagt efter en metode, hvor et markørprotein kan måles på en enkelt celle - uden at cellen er bundet til en fast fase.

Der er tidligere blevet udviklet såkaldte microfluidic-metoder. Nu er det lykkedes forskere at få RCA-reaktionen til at foregå inde i en dråbe af nanostørrelse (ref.10717). Kombinationen af de to teknikker muligør ultrafølsom analyse på enkeltceller.

Grundprincippet i microfluidic-teknologien er at indeslutte en enkelt celle i en meget lille dråbe (af nanoliter-størrelse) med RCA-reagenser.

De meget små dråber dannes i mikrokanaler. Dråben omsluttes af olie. Når der skal opnås dråber med kun en enkelt celle, vil der også være mange dråber uden celler til stede (eller med mere end én celle), men det kompenseres der for ved at fremstille et meget stort antal dråber i det automatiserede apparatur (ref.10717).

Metoden er blevet anvendt til at måle en specifik tumor-markør EpCAM (epithelial cell adhesion molecule). Den lave forekomst af denne markør har hidtil gjort det vanskeligt at måle den.

Hvis RCA i minidråber kombineres med cellesorteringsmetoder, vil det være muligt at isolere celler, der er positive for EpCAM, og dermed opnå en større mængde EpCAM-aktive celler til yderligere studier (ref.10717).

Hvordan kan man foretage ultrafølsomme analyser på enkeltceller?

Det er lykkedes forskere at få RCA-reaktioner til at foregå inde i en dråbe af nanostørrelse (ref.10717). Kombinationen af de to teknikker muligør ultrafølsom analyse på enkeltceller.

Minidråbe:RCA kombineret med en teknologi kaldet microfluidic nano-liter platform åbner en helt ny verden Ved mange af de tidligere anvendelser af RCA-teknologien foregik reaktionen på en fast overflade, hvor produktet fra RCA forblev bundet til den faste fase og altså blev påvist her.

Denne opsætning med en fast overflade er imidlertid ikke anvendelig i alle tilfælde, så forskere er gået på jagt efter en metode, hvor et markørprotein kan måles på en enkelt celle - uden at cellen er bundet til en fast fase.

Metoden er blevet anvendt til at måle en specifik tumor-markør EpCAM (epithelial cell adhesion molecule). Den lave forekomst af denne markør har hidtil gjort det vanskeligt at måle den.

Hvis RCA i minidråber kombineres med cellesorteringsmetoder, vil det være muligt at isolere celler, der er positive for EpCAM, og dermed opnå en større mængde EpCAM-aktive celler til yderligere studier (ref.10717).

Hvad er microfluidic-teknologien?

Grundprincippet i microfluidic-teknologien er at indeslutte en enkelt celle i en meget lille dråbe (af nanoliter-størrelse) med RCA-reagenser.

De meget små dråber dannes i mikrokanaler. Dråben omsluttes af olie. Når der skal opnås dråber med kun en enkelt celle, vil der også være mange dråber uden celler til stede (eller med mere end én celle), men det kompenseres der for ved at fremstille et meget stort antal dråber i det automatiserede apparatur (ref.10717).

Hvordan man kan analysere enkeltceller i heterogent væv?

Ved at kombinere RCA-teknologi med enzymmålinger kan man foretage såkaldt multiplekse analyser. Enzymtest: Der stilles store forventninger til RCA i multiplekse analyser RCA er indtil nu især blevet udviklet til at påvise nukleinsyrer (dvs. DNA og RNA), proteiner eller enzymaktiviteter. Men i fremtiden forventes det at blive muligt at videreudvikle RCA-teknologien til at måle forskellige molekyltyper og enzymaktiviteter i samme analyse (multiplekse analyser) (ref.10718).

Herved vil man kunne følge flere molekylære aktiviteter inde i en celle - selvom cellen befinder sig i et væv med andre celletyper (ref.10718).

Der kendes ikke andre analysemetoder, hvormed der kan udføres så komplekse analyser (ref.10718). Analyse af enkeltceller i heterogent væv kan bruges inden for kræftforskningen.

Følsom metode til påvisning af enzym-aktivitet: Når man ønsker at måle små mængder af et genprodukt, har det været almindeligt at bruge en kvantitativ PCR-reaktion, fordi PCR-teknologien kan måle små mængder. Men PCR-teknologien er som tidligere nævnt en kompleks teknologi, og den måler kun oligonukleotider (f.eks. mRNA) og ikke enzymaktiviteter.

Kan PCR-teknologien bruges til at måle enzymaktivitet?

Ved hjælp af PCR-metoden kan manmåle den mængde mRNA, der koder for et enzym, men man er ikke i stand til at måle, om enzymet er i en aktiv, dvs. katalyserende, form. I mange tilfælde er man netop mest interesseret i at måle selve enzymaktiviteten.

Kan RCA-teknologien bruges til at måle enzymaktivitet?

RCA-teknologien kan bruges til at måle enzymaktivitet. Forskere ved Århus Universitet har arbejdet med en metode til at måle aktiviteten af human topoisomerase I (ref.10715). Måling af dette enzym er interessant i forhold til visse kræftbehandlinger. Kemoterapi med stoffer fra camptothecin-familien rammer dette enzym, så ved at måle aktiviteten af topoisomerase-I kan man finde ud af, hvor godt behandlingen med camptothecin virker.

Enzymet topoisomerase I klipper hul i den ene streng af dobbeltstrenget, ringformet DNA, således at for høj spænding i den dobbeltstrengede DNA-ring afhjælpes. Dette hul skal efterfølgende lukkes ved sammenføjning (ligering). Denne klip-og-sy-reaktion er meget vigtig for en celles liv, men omstændighederne varierer fra organisme til organisme.

Ved at anvende specifikke sekvenser i de hjælpe-prober, der anvendes under analysen, kan man påvise, om en celle har modtaget et fremmed enzym med en anden specificitet, f.eks. på grund af en infektion.

Se den artiklen om malaria, hvor man anvender denne teknologi.

Minikugler: Minikugle-metode kombineret med RCA-metoden: I 2009 beskrev T. Konry og kollegaer en kombination af dels minikugle-analyser til at indfange de stoffer, der skal analyseres, og dels et RCA-baseret system til at opnå stærkt øget følsomhed af analysen (ref.10714).

Minikugler kan på overfladen bære monoklonale antistoffer til at indfange proteiner som f.eks. interleukin-8 (IL-8). Man bringer minikuglerne sammen med det protein, der skal bestemmes (i eksemplet her er proteinet altså interleukin-8). Med endnu et antistof får man interleukin-8 til at sidde i sandwich mellem de to antistoffer. Derefter udføres RCA-analyse til opformering af signalet. Trin A: En minikugle belagt med antistoffer mod f.eks. signalstoffet interleukin-8 indfanger dette stof. Trin B: Der sker en avidin/biotin-hjulpet binding til en indfangningsprobe, der ved hybridbinding er koblet til en hjælpeprobe. Det store molekyle avidin og det lille molekyle biotin bindes meget stærkt til hinanden. Til biokemiske analyser bruges denne avidin/biotin-binding meget ofte. Avidin kan binde sig til flere biotin-molekyler. Trin C: Hjælpeproben (også kaldet padlock probe, "låse-DNA-stykke") indfanger mål-DNA'et, fordi hjælpeproben har en sekvens, så hver ende hybridiserer til kendte områder i det DNA-målområde, der skal påvises. Trin D: Hjælpeproben bringer derved DNA-enderne sammen, så de kan lukkes med et enzym for at opnå en cirkeldannelse. Hullet lukkes af dette enzym, en DNA-ligase. Trin E: Der er nu tilvejebragt et grundlag for en RCA-amplifikation med det ringformede DNA som udgangspunkt (ref.10714). Trin F: Signalprober genkender og hybridiserer til dele af den dannede DNA-streng. Tilstedeværelsen af DNA-stykket er dermed bekræftet ud fra signalet fra signalproberne. F.eks. ved at hybridisere med fluorescensmærkede signalprober.

Med denne type analyse kunne man måle helt ned til 1 pM mål-DNA og 10 fM interleukin-8 i samme analyse (ref.10714).

Hvad er topoisomerase I?

Enzymet topoisomerase I klipper hul i den ene streng af dobbeltstrenget, ringformet DNA, således at for høj spænding i den dobbeltstrengede DNA-ring afhjælpes. Dette hul skal efterfølgende lukkes ved sammenføjning (ligering). Denne klip-og-sy-reaktion er meget vigtig for en celles liv, men omstændighederne varierer fra organisme til organisme.

Forskerne ved Århus Universitet er de første forskere, der har videreudviklet RCA-metoden til måling af en enzymaktivitet. (Denne videreudvikling kaldes REEAD; eng: rolling circle enhanced enzyme activity detection) (ref.10715)(ref.10705). RCA-test for malaria-version af enzymet topo-isomerase I skete på følgende måde: De danske forskere målte specifikt på aktiviteten af et for malariaparasitten livsnødvendigt DNA-klippe-og-lime-enzym, topoisomerase-I, i en blodprøve. Enzymet topoisomerase I, som påvises i testen, er et enzym, der findes hos alle levende organismer, idet det er helt essentielt for organismens overlevelse.

Forskerne ved Århus Universitet er de første forskere, der har videreudviklet RCA-metoden til måling af en enzymaktivitet. (Denne videreudvikling kaldes REEAD; eng: rolling circle enhanced enzyme activity detection) (ref.10715)(ref.10705). RCA-test for malaria-version af enzymet topo-isomerase I De danske forskere målte specifikt på aktiviteten af et for malariaparasitten livsnødvendigt DNA-klippe-og-lime-enzym, topoisomerase-I, i en blodprøve. Enzymet topoisomerase I, som påvises i testen, er et enzym, der findes hos alle levende organismer, idet det er helt essentielt for organismens overlevelse.

Topoisomerase I (ofte kaldet TopI) fremmer (ved katalytisk enzymaktivitet), at der sker brud på den ene streng i dobbeltstrenget DNA, hvorved der dannes et covalent enzym/DNA-mellemprodukt, som muliggør, at de afbrudte DNA-strenge igen sættes sammen - af det samme enzyms ligase-aktivitet (sammenlimning).

Enzymet kan altså både klippe og sy sammen. Denne aktivitet er livsnødvendig for at kunne fjerne skadelige spændinger, som kan opstå i dobbeltstrenget DNA.

De indledende forsøg på måling af enzymaktiviteten fra malariaparasitten i en lille spyt-prøve ser lovende ud (ref.10705).

Forskerne ved Institut for Molekylærbiologi og Genetik og Interdisciplinært Nanoscience Center ved Århus Universitet har videreudviklet RCA-teknologien til at ske i nano-dråber. Dermed har de frembragt den første diagnostiske test, som bygger på måling af en enzymaktivitet i den indtrængende organisme, her malariaparasitter (ref.10705).

Det regnes for mere sikkert at bygge en test på selve tilstedeværelsen af malariaparasitten end at forsøge at teste patientens immunreaktion eller eventuelle sygdomssymptomer.

Topoisomerase I stiller meget specifikke krav til den DNA-sekvens, den bindes til og spalter ved. Det er denne egenskab, der med stort held udnyttes i den nyudviklede metode (ref.10705). Enzymet varierer nemlig lidt fra organisme til organisme, og DNA-substratet tilsvarende. Denne forskellighed udnyttes i den nye testmetode.

Enzymet topoisomerase I er så vigtig for Plasmodium-arters overlevelse, at det ikke er gået tabt under evolutionen af Plasmodium-arterne. Der er således særdeles gode muligheder for at udvikle en specifik pan-malariatest, hvormed alle Plasmodium-arter kan påvises ved samme test.

Det er tidligere vist, at man kan måle human-TopI ved hjælp af RCA-metoden. De danske forskere fik så den idé, at de måske kunne måle TopI-aktiviteten fra Plasmodium i prøver fra en malaria-inficeret person og relatere dette til tilstedeværelsen af parasitten (ref.10705).

Dette krævede, at man kunne skelne mellem topoisomerase I fra mennesket (hTopI), og topoisomerase I fra malaria-Plasmodiumparasitten (pTopI).

For at måle parasittens topoisomerase I blev der anvendt et reaktionskammer af ekstrem lille størrelse. Metoden kaldes på engelsk ”droplet microfluidics platform”.

Kombinationen af RCA og ”droplet microfluidics platform” viste sig at give en meget følsom og specifik påvisning af tilstedeværelsen af malariaparasitter (ref.10705).

Principperne i analysen er følgende: Hvis der er pTopI (fra parasitten) tilstede i en blodprøve, der er taget af et menneske, der mistænkes for at være smittet med malaria, vil dette pTopI-enzym klippe hul i et nøje udformet testsubstrat (DNA) - og vil efterfølgende lukke hullet igen.

Det pågældende testsubstrat indeholder to DNA-sekvenser, som har betydning for påvisningen af klip/sy-aktiviteten.

Det er vigtigt at forstå, at specificiteten i analysen ligger i, at man lige netop tilbyder et stykke substrat-DNA, som er specifik for DNA-klip/sy-enzymet fra den organisme, som man ønsker at afsløre tilstedeværelsen af. (Hvis man vil påvise hTopI-enzymet, er det således et andet DNA-substrat, der skal anvendes, end hvis man vil påvise pTopI-enzymet). Man skal kunne skelne mellem dem, da der altid vil være hTopI tilstede, når man tester for pTopI.

Man tilfører et DNA-stykke, som kan fungere som primer for en DNA-polymerase. (Desuden tilfører man de til DNA-syntesen nødvendige fire typer af deoxyribonukleotider).

DNA-polymerasen kopierer nu det cirkulære DNA gang på gang – f.eks. 1000 gange. Den ene kopi efter den anden kommer derved til at ligge sammenkoblede som perler på en snor.

Den RCA-baserede test for malariainfektion er så følsom, at den giver et positivt udslag ned til at der i gennemsnit kun er 0,06 parasit pr. mikroliter (ref.10705). (Dette kan sammenlignes med, at de mest optimale protokoller for PCR kan måle ned til 0,01-1 parasit pr. mikroliter (ref.10705)).

Metoden forventes at kunne anvendes til at teste for malaria i en lille spytprøve (ref.10705).

Kan man udvikle vaccine mod malaria?

Forskere fra Center for Medicinsk Parasitologi ved Københavns Universitet har været førende i opdagelsen af, hvordan malariaparasitter undviger kroppens immunforsvar - og får lov til at hobe sig op i hjernen, hvilket ofte fører til dødbringende sygdom.

Den nye viden bringer en vaccine mod malaria inden for rækkevidde og styrker hele forskningsområdet.

Tidligere var det i Danmark svært at få økonomisk støtte til malariaforskning, fordi der i mange år har været fokus på kræftforskning. Desuden er langt de fleste personer, der får malaria, at finde blandt verdens fattigste, hvilket ikke har gjort det attraktivt at udvikle medicin og vaccine mod malaria. Trods dette er dansk malariaforskning epokegørende.

Malaria er udbredt i tropiske og subtropiske områder, specielt i Afrika. Der importeres 150-200 tilfælde af malaria til Danmark om året (ref.107019). Malaria er altså ikke en almindelig sygdom i Danmark, men danske forskere har i mange år været fremtrædende inden for malariaforskning på et internationalt højt plan. Malaria er et stort problem på verdensplan Malaria er en infektionssygdom, som skyldes en gruppe af malariaparasitter af slægten Plasmodium, hvoraf Plasmodium falciparum er den farligste for mennesker.

Plasmodium-parasitterne er encellede organismer, som kan leve som parasitter i bl.a. mennesket og i en bestemt stikmyg ved navn Anopheles (ref.107019).

Man regner med, at der i år 2010 opstod omkring 216 millioner nye malariatilfælde i verden, hvoraf omkring 655.000 havde dødelig udgang (ref.107019).

De fleste, der dør af malaria, er børn under 5 år. Børn er særligt sårbare, fordi de endnu ikke har en færdigudviklet, naturlig immunitet (ref.107019).

Malaria-parasitten skjuler sig for menneskets immunsystem i de røde blodlegemer En infektion med malaria-parasitter kan udvikle sig livstruende, fordi parasitterne har en evne til at undgå kroppens naturlige immunforsvar.

Parasitterne opformerer sig i de røde blodlegemer, og får de røde blodlegemer til at udtrykke et parasit-afledt vedhæftningsprotein på overfladen af de røde blodlegemer (ref.10720). Dette parasitprotein bindes til celler i blodkarvæggen, og der kan ske roset-dannelse med binding af ikke-inficerede røde blodlegemer. Der sker også en blodplade-hjulpet sammenklumpning af inficerede røde blodlegemer. Disse forhold kan føre til blodprop.

Det har vist sig, at malariaparasitten er utrolig dygtig til at variere vedhæftningsproteinet, som kaldes PfEMP1-proteinet (P.falciparum-erythrocyte-membrane-protein-1). Der foregår et sandt kapløb om liv eller død. Der er således fundet omkring 60 varianter af proteinet (ref.10722).

Genet, der koder for PfEMP1-proteinet, blev klonet i 1995. Derved blev det muligt at studere vedhæftningen på molekylplan. Men der er rigtig mange parametre at undersøge.

Malariaparasitten bærer gener, der koder for mange varianter af vedhæftningsproteinet, og endothel-cellerne har rigtig mange klæbe-molekyler på celleoverfladen, dvs. molekyler, hvortil parasit-afledte proteiner kan binde sig (ref.10720). Kombinationerne er mange, og der skal derfor komplekse metoder til for at undersøge disse mange kombinationer. Den mulige malaria-vaccine Antistoffer mod de forskellige malaria-antigener, der dannes undervejs i malariaparasittens livsstadier i blodet, kan være vigtige for opnåelse af beskyttende immunitet og er derfor mulige vaccinekandidater (ref.10721).

I 2011 var forskere fra Center for Medicinsk Parasitologi ved Københavns Universitet med til at undersøge, hvordan individer, der ikke tidligere har været i kontakt med malaria-smitte, ville reagere på malaria-smitte. Der blev testet 104 PfEMP1-domæner (fremstillet ved genteknologi). De blev testet i hollandske forsøgspersoner for at se, hvornår der kom et antistof-svar i forsøgspersonen. Hvis et PfEMP1-domæne fremkaldte et hurtigt antistofsvar, var det en potentiel kandidat til en vaccine (ref.10721).

Infektionen blev påført via myggestik fra Anopheles stephensi myg, der var inficeret med ét af de rekombinante PfEMP1-domæner.

Det var således et meget realistisk scenarie med en ”naturlig” infektionsmetode. Forsøget blev stoppet, efter at malariaparasitten havde delt sig aseksuelt et par gange (for ikke at påføre forsøgspersonen for stor risiko for at få en ukontrollerbar malaria).

På trods af det meget korte infektionsforløb, blev der observeret PfEMP1-antistoffer i omkring 60% af forsøgspersonerne.

Dette resultat tegnede godt, men der kunne ikke etableres en sammenhæng mellem omfanget af infektionen og bredden af antistof-svaret. En af deltagerne udviklede kun antistoffer mod ét domæne, medens en anden udviklede antistoffer mod 38 domæner af de i alt 104 domæner. Malaria- parasitten helgarderer Malariaparasitten helgarderer sig ved at udtrykke de fleste domæner, når parasitten går ind i blodstadiet. Den kender jo ikke antistof-reaktionen hos den nye vært, så den vælger at være på den sikre side og sørge for, at stort set alle domæner bliver udtrykt samtidigt. Denne strategi giver malaria-parasitten gode muligheder for at overleve og fremkalde en kronisk infektion.

Epidemiologiske data tyder på, at alvorlig malaria er knyttet til visse velbevarede domæner af PfEMP1. Metodemæssigt er dette dog svært at undersøge. Forskere fra Center for Medicinsk Parasitologi ved Københavns Universitet kombinerede to metoder, som hver især ikke var helt gode, men som tilsammen gav et tydeligt resultat.

De fandt, at uanset hvilke symptomer et meget malaria-sygt barn havde, kunne de påvise, at transskription (DNA-aflæsning) af domæne cassette nummer 8 (DC8) var meget forhøjet. Der var også forhøjet transskription fra DC13-domænet. Deres forskning pegede således på to gode vaccinekandidater (ref.10722). Malariaparasit-bindingsstedet De danske forskere fulgte imidlertid også en anden angrebsstrategi. Hvis man kunne finde det sted i blodårerne, hvor malariaparasittens protein sætter sig fast, så kunne man arbejde på at forhindre, at røde blodlegemer med malariaprotein på ydersiden kunne sætte sig fast.

Hvis parasitholdige røde blodlegemer ikke kan hægte sig fast, vil de blive ført til milten (blodets rensningsanlæg) til tilintetgørelse, og parasitten vil gå til grunde(ref.10723).

Forskernes mål var således at finde ud af, hvilke af menneskets tusinder af receptorer i blodkarrene, som parasitterne bindes til. Det krævede screening af over 2500 proteiner.

Det første skridt var at genskabe hele PfEMP1-proteiner ved genteknologi i laboratoriet. Dernæst blev delstykker af hele PfEMP1-molekylet analyseret for binding til proteiner i cellevæggen af menneskets blodkar.

De danske forskere samarbejdede med det engelske firma Retrogenix, som har specialiseret sig i at få celler til at producere forskellige proteiner på cellemembran-overfladen.

Ved at teste det ene protein efter det andet fandt man ud af, hvilke af karvæggenes flere tusinde proteiner, som en oprenset version af malaria-parasittens PfEMP1-protein bindes stærkest til.

Dette pegede éntydigt på menneskets overfladeprotein EPCR (eng: endothelial protein C receptor).

EPCR-overfladeproteinet er en utrolig vigtig receptor i kroppen. Den sidder centralt i den signalvej, der kontrollerer både kroppens immunforsvar, cellevæggenes integritet og blodkoagulering. Hvis der sker en øget blodkoagulering i hjernen, er der stor risiko for dannelse af blodprop i hjernen. Blodpropper er en af hovedårsagerne til, at folk dør af hjernemalaria (ref.10723).

Mulige mål for vacciner er altså blokering af parasittens DC8 og DC13 hæfteproteiner, og bindingen til menneskets EPCR-receptor.Der er store perspektiver ved spyttest-teknologi - som f.eks. hvis man ved simple spyttest i fattige udviklingslande kan teste for malaria.

Kan RCA-teknologien bruges til at påvise enzymer?

Forskerne ved Århus Universitet er de første forskere, der har videreudviklet RCA-metoden til måling af en enzymaktivitet. (Denne videreudvikling kaldes REEAD; eng: rolling circle enhanced enzyme activity detection) (ref.10715)(ref.10705). RCA-test for malaria-version af enzymet topo-isomerase I skete på følgende måde: De danske forskere målte specifikt på aktiviteten af et for malariaparasitten livsnødvendigt DNA-klippe-og-lime-enzym, topoisomerase-I, i en blodprøve. Enzymet topoisomerase I, som påvises i testen, er et enzym, der findes hos alle levende organismer, idet det er helt essentielt for organismens overlevelse.

Kan en spyttest påvise malaria? ?

Cirkel-DNA metoden (RCA-teknologien) er anvendt til test for malaria ved en spyttest. En dansk forskergruppe ved Århus Universitet har også udviklet en RCA-baseret test til påvisning af malariaparasitter i blod. Med RCA-metoden kunne de måle en bestemt enzymaktivitet, som afslører malariaparasittens tilstedeværelse (ref.10705).